Western blot檢測技術

（一） 基本原理　免疫印跡又稱Western印跡（Western  blot），與DNA的Southern印跡技術相對應，兩種技術均把電泳分離的組分從凝膠轉移至一種固相載體（通常為NC膜），然后用探針檢測特異性組分。不同的是，Western blot所檢測的是抗原類蛋白質成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應。該技術結合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復雜混合物中對特定抗原進行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的*性。該技術的靈敏度能達到標準的固相放射免疫分析的水平而無需對靶蛋白進行放射性標記。

目前，Western blot廣泛用于蛋白質研究、基礎研究和臨床醫(yī)學的研究。

（二） 基本方法　先將待檢測樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （PAGE）分離各組分，然后通過印跡技術把分離樣品幾乎原位、定量轉移到NC膜上。隨后進行類似間接ELISA法測抗原的反應，即用特異抗體與NC膜上的靶抗原反應，結合上的抗體可用與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白進行反應，zui后通過與酶的底物發(fā)生顯色反應來做檢測。

實際操作時，常把印跡后的NC膜分成兩部分，一部分如上所述做免疫檢測，另一部分直接進行蛋白質染色，以便對轉移情況做直接觀察和判斷待測抗原所處位置及推算其分子量。

操作方法具體如下：

1.樣品的制備　樣品的制備方法的選擇取決于樣品的類型和待測抗原的性質。細菌樣品一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解。哺乳動物組織通?？蓹C械分散并直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液。組織培養(yǎng)的單層細胞可用去污劑溫和裂解，也可直接在SDS凝膠加樣緩沖液中裂解。制備好的樣品用做SDS-PAGE分析。

2.蛋白質的SDS-PAGE分析　PAGE過程有三種物理效應可使樣品分離開來，包括樣品的濃縮效應、凝膠的分子篩效應、一般電泳的電荷效應。因此，樣品分離效果好，分辨力高。

而SDS-PAGE是將強陰子去污劑十二烷基磺酸鈉（SDS）與還原劑巰基乙醇并用，并通過加熱，使蛋白質解離成多肽后再加樣于電泳凝膠上。由于各種SDS-多肽復合物均帶負電，且形狀近似，因此，該復合物在電場中的遷移率只取決于蛋白質的大小，這樣通過SDS-PAGE可將不同大小的蛋白質樣品分離開來，借助已知分子量的標準參照物，可推算出相應的分子量。（三）將蛋白質從凝膠轉移到NC膜上  操作方法如下：

（1） 剪6塊粗濾紙和一塊NC膜（大小應與凝膠一致），并在轉移緩沖液（48 mmol/L Tris.HCl，39 mmol/L甘氨酸，0.037％SDS）中浸泡3-5分鐘。

（2） 將轉移電泳槽塑料支架平放，依次置放海綿、3塊濾紙、NC膜、凝膠及另外3塊濾紙和海綿，放置過程注意驅除夾層間氣泡。用支架夾緊上述各層，置電轉移槽中，NC膜一側靠正極，凝膠一側靠負極。

（3） 接通電源，40V、約1.轉移1.5-6小時。轉移時間長短依靶蛋白分子量大小來調節(jié)。

（4） 轉移結束，取出NC膜做好上、下端標記，切下一小條做蛋白質染色處理，以檢查轉移效果。

（5） 將NC膜（WHATMAN 10401196）置干凈濾紙上，室溫自然干燥。

4.封閉　這一步處理的目的在于封閉NC膜上一些非特異性蛋白質的潛在結合位點，以避免非特異性反應。通常是在PBS緩沖液中加入1％脫脂奶粉或牛血清白蛋白配成封閉液，并將 NC膜浸泡其中，室溫封閉1小時左右。

5.（五）免疫檢測和顯色反應　包括NC膜與*抗體、酶標抗抗體（即第二抗體）反應，以及用酶相應的底物處理進行顯色反應。

（1） 將封閉好的NC膜浸入*抗體溶液中，抗體液依0.2ml/cm2調節(jié)用量，室溫或37℃溫和振蕩反應1-2小時。

（2） 棄去抗體液，用PBS洗滌。

（3） 將NC膜浸入酶標第二抗體反應液，用量與一抗相同，37℃或室溫輕振蕩1-2小時。

（4） 棄二抗反應液，PBS洗滌。

（5） 將膜放入相應顯色液中，觀察顯色反應。陽性反應將在靶蛋白相對應的位置上出現(xiàn)有顏色的條帶，而其余位置無顯色條帶出現(xiàn)。

（三） 免疫印跡技術的應用實例　用免疫印跡技術可定性、定量地檢測出待檢樣品中含量很低的特定病原體的抗原成分。對于一些能感染細胞而細胞病變不易觀察的病原體的檢測也很有用。用單克隆抗體做為*抗體進行免疫印跡，還可以對毒株做分型研究。

1990年，西班牙等一些發(fā)現(xiàn)有非洲豬瘟的國家已將ELISA結合Western blot技術廣泛應用于非洲豬瘟病毒（ASFV）抗體的檢測以幫助實施ASFV撲滅計劃。先用ELISA技術對大批血清樣品進行初篩，隨后用Western blot技術對陽性樣品進一步做驗證，可有效排除假陽性反應。 1995年，Alcaraz.C等應用基因工程技術成功建立了特異性更為理想的重組Western blot技術。他們用大腸桿菌系統(tǒng)克隆并表達了ASFV抗原性病毒結構蛋白p54，將重組p54做為抗原建立了Western blot檢測技術。原有的Western blot技術所用的抗原是通過病毒感染哺乳動物細胞而分離獲得，不可避免有細胞雜蛋白干擾。而應用重組蛋白做為抗原，成分專一，可保證檢測結果的高度特異，還能避免將活毒應用于檢測試驗所可能帶來的散毒危險。